遺伝子編集がついにノーベル化学賞を受賞！二人の女性科学者が成果を上げましたが、なぜ張鋒さんはそうしなかったのでしょうか?

著者 |ファンプ

北京時間10月7日夜、遺伝子編集への貢献が認められ、エマニュエル・シャルパンティエとジェニファー・A・ダウドナに2020年のノーベル化学賞が授与されました。

受賞者について:

エマニュエル・シャルパンティエ博士はフランスの微生物学者であり、現在はドイツのマックス・プランク研究所の感染生物学研究所の所長を務めています。 CRISPR の開発において、彼の主な貢献は、Cas9 タンパク質の活性が tracrRNA に依存するという発見でした。

ジェニファー A. ダウドナ博士は、バークレー大学の化学、分子生物学、細胞生物学の教授であり、ハワード・ヒューズ医学研究所の研究員であり、米国科学アカデミーの会員です。エマニュエル・シャルパンティエ博士とともに、Cas9の切断機能とcrRNAの位置決め機能を発見し、crRNAとtracrRNAを一本鎖ガイドRNA（sgRNA）に融合した。

関連分野の専門家は、中国の科学者張鋒氏がCRISPR-Cas9を使用して真核細胞の遺伝子編集を初めて実現したが、賞を獲得できなかったと分析した。それは、張鋒の研究が独創性に欠け、彼の貢献が細胞組み換えにおけるコーエンとボイヤーの貢献に近いからかもしれない（1980年の化学賞は人工組み換えでバーガーに授与された）。化学賞では試験管内実験結果に重点が置かれ、彼の画期的な成果は主に細胞に反映されています。

CRISPR はすでにバイオ医学の分野で非常に人気のある遺伝子編集技術です。近年、この技術は急速に発展し、生物学、医学、農業、環境など多くの分野に応用され、特に遺伝病の治療、疾患関連遺伝子のスクリーニングと検出、腫瘍治療、動植物の形質転換、病原微生物の予防と制御などの分野で、一連の科学研究の奇跡を生み出しています。それは大きな可能性を秘めており、世界全体に大きな影響を及ぼすでしょう。

1. CRISPRとは何ですか? CRISPR の正式名称は Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats で、中国語では「規則的にクラスター化された短い回文反復」と翻訳されます。この単語の文字通りの意味は、「明らかな特徴、きちんとした配置、一貫した順序を備えた同じタイプの繰り返しシーケンスを表す」ことです。細菌の適応免疫システムとして機能します。外来ウイルスまたはプラスミド DNA が細胞内に入ると、特殊な Cas タンパク質が外来 DNA を小さな断片に切断し、自身の DNA 断片に貼り付けて保存します。再びウイルスの侵入に遭遇すると、細菌は保存された断片に基づいてウイルスを認識し、ウイルスのDNAを切断して無効にします[1]。

科学者たちは CRISPR のこの機能を利用して、それを革新的な新しい分子ツールに変換しました。あらゆるタイプの遺伝物質を正確に見つけて切断する能力があるため、科学者は地球上のあらゆる生物（人間を含む）の生命コードをより簡単に解読することができます。

1. CRISPRの簡単な歴史

図1: CRISPR開発の簡単な歴史

CRISPRの発見と命名は1987年に遡ります。当時、日本の大阪大学の中田研究グループが大腸菌を分析していたところ、細菌内に異常な反復配列を発見しました[2]。しかし、当時は、これらの反復配列の正確な機能がわかっておらず、正式な名前さえ付けられていませんでした。 1980年代後半になって、スペインのアリカンテ大学のフランシスコ・モヒカが古細菌種で​​同様の反復配列を発見し[3]、大きな関心を抱くようになりました。その後の研究で、彼は微生物における類似の構造を探し続け、2000年までに20種類以上の微生物種で類似の配列を発見しました[4]。 2002年、オランダのユトレヒト大学のルート・ヤンセンは、反復配列の塩基数は種によって大きく異なり、そのような配列は原核生物にのみ存在することを発見しました。関連研究をより標準化するために、彼らはこの反復配列を共同で「CRISPR」と名付けました。 。複数のCRISPR関連遺伝子はCas（CRISPR関連）ファミリーと名付けられている[5]。

CRISPR-CAS システムの生物学的役割 2005 年、CRISPR 研究は重要な発見をもたらしました。 2つの研究グループ（モヒカとポルセル）は、CRISPRリピート配列間のスペーサー配列は原核生物自体からではなく、プラスミドまたはウイルスから来ていることを観察しました[6-7]。そこでモヒカ氏は、CRISPR は適応免疫システムであるという仮説を提唱した。同年、ボロティンの研究グループは、ストレプトコッカス・サーモフィルスで Cas9 を発見し、この大きなタンパク質がヌクレアーゼ活性を持つと予測しました。また、ウイルスに相同なスペーサー配列はすべて、標的配列の認識に重要なPAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列と呼ばれる類似の尾部を持っていることも発見した。

この仮説に触発され、当時有名なヨーグルト会社ダニスコに勤務していたフランスの微生物学者ロドルフ・バラグーは、ヨーグルト製造に影響を与えるファージ感染とサーモフィルス菌の死滅の問題を解決するために、この仮説を検証することを決意しました。 2007年、彼らはCRISPRシステムが実際に適応免疫システムであることを実験的に実証しました。ウイルスに侵入された後、Streptococcus thermophilusはファージゲノムから新しいスペーサー配列を組み込み、同じウイルスが再び侵入したときに細菌が攻撃に抵抗できるようにします[8]。この免疫の生成には Cas9 タンパク質が必要である可能性があります。 CRISPR-Casが細菌の獲得免疫システムであることが実験的に確認されたのは今回が初めてです。

CRISPR-CAS の生物学的機能の確認により、多くの研究チームがこのシステムの重要性を認識するようになりました。その後、多くの研究チームが、CRISPR-Casシステムがバクテリオファージに干渉するメカニズムの詳細を補足し始めました。 2008年、ジョン・ファン・デル・オーストの研究グループは、大腸菌において、バクテリオファージのスペーサー配列が小さなRNAに転写されてCRISPR RNA（crRNA）となり、Casタンパク質を標的DNAに誘導することを発見しました。同年、マラフィニとゾントハイマーは、CRISPR-Casシステムの標的分子はRNAではなくDNAであることを実証した。彼らはまた、このシステムが非細菌系に移植されれば、強力なツールシステムになる可能性があることを明確に指摘した[9-10]。これがその後の遺伝子編集の基礎となった。

2010 年 12 月、モワノーのチームは、CRISRP-Cas9 が PAM 配列の上流を正確に切断して DNA に二本鎖切断を作り出すことを実証しました。タイプII CRISPRシステムの顕著な特徴として、Cas9は切断に必要な唯一のタンパク質であり、crRNAと連携してCRISPR-Cas9の干渉機能を媒介します[11]。

2011年、シャルパンティエの研究グループは、化膿連鎖球菌の小さなRNAの配列を解析し、crRNAに加えてtracrRNAと呼ばれる別の小さなRNAがあることを発見しました。 tracrRNA は、crRNA 内の繰り返し配列を 24 ヌクレオチドにわたって補完して二重鎖を形成し、Cas9 をターゲット DNA に誘導します。この時点で、天然のCRISPR-Cas9干渉メカニズムの謎は基本的に解明されている[12]。

CRISPR-CAS 遺伝子編集技術の登場 2012 年、シャルパンティエとダウドナのチームは協力して、Cas9 が二本鎖 DNA を切断する能力があることを証明しただけでなく、tracrRNA と crRNA を sgRNA (シングル ガイド RNA) にリンクし、sgRNA が Cas9 タンパク質を誘導して二本鎖 DNA の切断を完了できることも in vitro 実験で確認しました。 crRNAの配列を変更することでCas9の標的部位を制御することができる[13]。シクスニース氏のチームもその後、同じ調査結果を報告した。この発見は、細菌獲得免疫システムの分野における画期的な出来事であるだけでなく、CRISPR-CAS 遺伝子編集技術の新たな章を開くものでもあります。すぐに、2013 年初頭にいくつかの論文が CRISPR-Cas システムを哺乳類細胞に適用することに成功しました。その中で、チャーチ研究グループは、タイプII CRISPR-Casシステムを設計し、sgRNAを設計することでヒト293T細胞、K562細胞、誘導多能性幹細胞の特定の配列を標的にすることに成功し、複数のgRNAが標的遺伝子の複数の編集を達成することができました[14]。張鋒の研究室は、CRISPR-Cas9システムがヒトとマウスの細胞で正確な部位特異的切断を実行できることを実証し、Cas9をニッカーゼに変異させて相同性修復プロセスを促進しました[15]。 Qiの研究グループはCRISPRiシステムを確立し、複数のsgRNAを使用して複数の遺伝子（Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty）の同時部位特異的変異誘発を達成しました[16]。 Wu et al. CRISPR-Cas9システムを用いて優性Crygc変異を持つマウスに遺伝子治療を行い、健康な子孫を得た。これは、遺伝性疾患の遺伝子治療にCRISPR-Cas9システムを使用する基礎を提供した[17]。

その結果、遺伝子部位編集、ゲノムスクリーニング、遺伝子転写制御、ゲノムイメージング、遺伝子診断と治療、さまざまな生物の生態学的応用の分野で、CRISPR システムの研究と応用が爆発的に増加し始めました。その後数年間、張鋒の研究室はCRISPR-CAS遺伝子編集システムをさらに拡張し、特異性と多重遺伝子編集に大きな利点を持つCRISPR-CasシステムであるCRISPR-Cpf1[18]を発見しただけでなく、RNase機能を持つCRISPR酵素Cas13a（C2c2）[19]とCas13b[20]も発見しました。 2017 年には、CRISPR-Cas13 システムの作用メカニズム、臨床診断への応用、哺乳類細胞内の RNA を標的とする能力について研究した論文がいくつか発表されました。

1. CRISPR 遺伝子編集技術の応用 CRISPR 技術の急速な発展により、トランスレーショナル メディシンや疾患治療の分野で驚きを生み出し続けています。 2015年、サイエンス誌は、CRISPRを遺伝性疾患の動物モデルの治療に効果的に使用する方法を発表しました。彼らはCRISPRシステムを使用してジストロフィン遺伝子を編集し、デュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスの筋肉機能をさまざまな程度に修復し、DMDの治療効果を達成しました[21]。 2018年の研究では、CRISPR技術を使用してDMD（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）を患う4匹の犬を治療し、筋肉と心臓組織のジストロフィンタンパク質を正常レベルの92%まで回復させたことが確認されました[22]。さらに、CRISPR 技術は細胞免疫療法と組み合わせられ、CAR-T 療法を改善し、マウスの腫瘍抑制を強化しました。 CRISPR-Cas9を用いてT細胞のPD-1遺伝子をノックアウトする最初の臨床試験は、筋浸潤性膀胱癌、去勢抵抗性前立腺癌、転移性腎癌、転移性非小細胞肺癌の治療薬として承認されており、第I相臨床試験は2016年に開始された[23]。
2. CRISPR のその他の用途 現在、CRISPR はゲノム編集に使用されるだけでなく、遺伝子検査においても大きな可能性を示しています。 2017年にサイエンス誌に発表された研究で、ダウドナのチームは興味深い現象を発見しました。CRISPRシステムが標的の二本鎖DNAを切断すると、Cas12のDNA酵素活性が活性化されるというものです[24]。この発見は、細胞に特定の標的 DNA が含まれているかどうかを検出するための新しいアイデアを提供します。DNA を標的とする CRISPR-Cas12a システムと非特異的 ssDNA 蛍光レポーター遺伝子 (FQ ラベル レポーター) が同時に細胞に送達されます。標的DNAが検出されると、CRISPR-Cas12aシステムが活性化され、同時に蛍光レポーター遺伝子が分解され、蛍光シグナルが放出されます。ダウドナ氏のチームはこの技術を利用して、1回の検査につき1ドル未満のコストで、1時間以内に100%の精度でHPV16感染を検出できるDETECTRシステムを開発した。同時に、張峰のチームもCRISPR-Cas13aを使用してSHERLOCKシステムとSHERLOCKv2システムを開発しました[25]。ダウドナ氏のチームとは異なり、張鋒氏のチームが設計した蛍光レポーター遺伝子は特異的でなければならない。まさにこの「特異性」の利点により、SHERLOCKv2 は複数のシーケンスを同時に検出できるようになります。張峰氏のチームは、妊娠検査スティックに似た検査ストリップ検出法も開発した。 SHERLOCKv2 は、たった 1 本のテストストリップでウイルス感染の検査結果を表示できるため、検出がより便利になります。 SHERLOCKv2は今年、COVID-19検出技術の開発にも貢献した。

DETECTR と SHERLOCK は強力な診断能力を示していますが、臨床使用に導入される前に、研究者は診断の正確性を確保するためにまだ多くの作業を行う必要があります。私たちは、これらの新しい診断ツールが将来の診断技術を書き換え、特に衛生状態が比較的悪く、ウイルスが蔓延している発展途上国におけるウイルス感染の診断に大きく役立つと信じています。 。

参考文献

1. Doudna JA、Charpentier E. ゲノム編集。 CRISPR-Cas9 によるゲノム工学の新たなフロンティア。科学。 2014年11月28日;346(6213):1258096.出典：10.1126/science.1258096. PMID: 25430774.．

2. 石野 勇、品川 浩、牧野 健、雨村 正、中田 明. 大腸菌におけるアルカリホスファターゼアイソザイム変換に関与するiap遺伝子のヌクレオチド配列と遺伝子産物の同定。 Jバクテリオール。 1987年12月;169(12):5429-33.土井: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987。 PMID: 3316184; PMCID: PMC213968。

3. ランダーES。 CRISPR のヒーローたち。細胞。 2016年1月14日;164(1-2):18-28.出典：10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID: 26771483。

4. Mojica FJ、Díez-Villaseñor C、Soria E、Juez G. 古細菌、細菌、ミトコンドリアのゲノムにおける規則的に間隔を置いた反復配列ファミリーの生物学的意義。モルマイクロバイオール。 2000年4月;36(1):244-6.土井: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x。 PMID: 10760181。

5. ヤンセン R、エンブデン JD、ガストラ W、スクールズ LM。原核生物の DNA 反復に関連する遺伝子の特定。モルマイクロバイオール。 2002年3月;43(6):1565-75.土井: 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x。 PMID: 11952905。

6. Mojica FJ、Díez-Villaseñor C、García-Martínez J、Soria E. 規則的に間隔を空けた原核生物反復配列の介在配列は外来遺伝要素に由来する。分子進化論2005年2月;60(2):174-82.土井: 10.1007/s00239-004-0046-3。 PMID: 15791728。

7. Pourcel C、Salvignol G、Vergnaud G. Yersinia pestis の CRISPR 要素はバクテリオファージ DNA の優先的な取り込みによって新しい反復を獲得し、進化研究のための追加ツールを提供します。微生物学。 2005年3月;151(Pt3):653-663.出典：10.1099/mic.0.27437-0. PMID: 15758212。

POURCEL C、SALVIGNOL G、VERGNAUD G. Yersinia pestisのCRISPR要素はバクテリオファージDNAの優先的な取り込みによって新しい反復を獲得し、進化研究のための追加ツールを提供します[J]。微生物学、2005年、15l(3):653-663。

8. Barrangou R、Fremaux C、Deveau H、Richards M、Boyaval P、Moineau S、Romero DA、Horvath P. CRISPR は原核生物のウイルスに対する獲得耐性を提供します。科学。 2007年3月23日;315(5819):1709-12.出典：10.1126/science.11​​38140. PMID: 17379808。

9. マラフィーニ LA、ソントハイマー EJ. CRISPR 干渉は DNA を標的にしてブドウ球菌における遺伝子の水平伝播を制限します。科学。 2008年12月19日;322(5909):1843-5.出典：10.1126/science.11​​65771.提出期限: 19095942 PMCID: PMC2695655。

10. アボット A. 静かな革命家: CRISPR の共同発見がエマニュエル・シャルパンティエの人生をいかに爆発的に変えたか。自然。 2016年4月28日;532(7600):432-4.出典: 10.1038/532432a. PMID: 27121823。

11. Garneau JE、Dupuis MÈ、Villion M、Romero DA、Barrangou R、Boyaval P、Fremaux C、Horvath P、Magadán AH、Moineau S. CRISPR/Cas 細菌免疫システムは、バクテリオファージとプラスミド DNA を切断します。自然。 2010年11月4日;468(7320):67-71.出典：10.1038/nature09523. PMID: 21048762。

12. Deltcheva E、Chylinski K、Sharma CM、Gonzales K、Chao Y、Pirzada ZA、Eckert MR、Vogel J、Charpentier E. トランスエンコードされた小RNAと宿主因子RNase IIIによるCRISPR RNAの成熟。自然。 2011年3月31日;471(7340):602-7. doi: 10.1038/nature09886. PMID: 21455174; PMCID: PMC3070239。

13. Jinek M、Chylinski K、Fonfara I、Hauer M、Doudna JA、Charpentier E. 適応性細菌免疫におけるプログラム可能なデュアルRNA誘導DNAエンドヌクレアーゼ。科学。 2012年8月17日;337(6096):816-21.出典：10.1126/science.1225829. Epub 2012年6月28日. PMID: 22745249; PMCID: PMC6286148。

14. Cong L、Ran FA、Cox D、Lin S、Barretto R、Habib N、Hsu PD、Wu X、Jiang W、Marraffini LA、Zhang F. CRISPR/Cas システムを使用したマルチプレックスゲノムエンジニアリング。科学。 2013年2月15日;339(6121):819-23.出典：10.1126/science.1231143. Epub 2013年1月3日。PMID: 23287718; PMCID: PMC3795411。

15. マリ P、ヤン L、エスベルト KM、アーハ J、グエル M、ディカルロ JE、ノーヴィル JE、チャーチ GM。 Cas9 を介した RNA 誘導ヒトゲノム工学。科学。 2013年2月15日;339(6121):823-6.出典：10.1126/science.1232033. Epub 2013年1月3日。PMID: 23287722; PMCID: PMC3712628。

16. Pennisi E. CRISPR の流行。科学。 2013年8月23日;341(6148):833-6.出典：10.1126/science.341.6148.833. PMID: 23970676。

17. Wu Y、Liang D、Wang Y、Bai M、Tang W、Bao S、Yan Z、Li D、Li J. CRISPR-Cas9 を使用したマウスの遺伝性疾患の修正。細胞幹細胞。 2013年12月5日;13(6):659-62.土井: 10.1016/j.stem.2013.10.016。 PMID: 24315440。

18. Zetsche B、Gootenberg JS、Abudayyeh OO、Slaymaker IM、Makarova KS、Essletzbichler P、Volz SE、Joung J、van der Oost J、Regev A、Koonin EV、Zhang F。 Cpf1 は、クラス 2 CRISPR-Cas システムの単一の RNA 誘導型エンドヌクレアーゼです。細胞。 2015年10月22日;163(3):759-71.出典：10.1016/j.cell.2015.09.038. Epub 2015年9月25日. PMID: 26422227; PMCID: PMC4638220。

19. Gootenberg JS、Abudayyeh OO、Kellner MJ、Joung J、Collins JJ、Zhang F. Cas13、Cas12a、Csm6 を使用したマルチプレックス化およびポータブル核酸検出プラットフォーム。科学。 2018年4月27日;360(6387):439-444.出典：10.1126/science.aaq0179.電子出版 2018年2月15日. PMID: 29449508; PMCID: PMC5961727。

20. Cox DBT、Gootenberg JS、Abudayyeh OO、Franklin B、Kellner MJ、Joung J、Zhang F. CRISPR-Cas13 による RNA 編集。科学。 2017年11月24日;358(6366):1019-1027.出典：10.1126/science.aaq0180.電子出版 2017年10月25日. PMID: 29070703; PMCID: PMC5793859。

21. ロング C、アモアシ L、ミロー AA、マカナリー JR、リー H、サンチェス-オルティス E、バタチャリヤ S、シェルトン JM、バッセル-デュビー R、オルソン EN。出生後のゲノム編集により、筋ジストロフィーのマウスモデルにおけるジストロフィン発現が部分的に回復した。科学。 2016年1月22日;351(6271):400-3.出典：10.1126/science.aad5725. Epub 2015年12月31日。PMID: 26721683; PMCID: PMC4760628。

22. Ridler C. CRISPR 療法はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに有望である。国立神経学会誌2018年11月;14(11):632-633.土井: 10.1038/s41582-018-0078-8。 PMID: 30237553。

23. Burr ML、Sparbier CE、Chan YC、Williamson JC、Woods K、Beavis PA、Lam EYN、Henderson MA、Bell CC、Stolzenburg S、Gilan O、Bloor S、Noori T、Morgens DW、Bassik MC、Neeson PJ、Behren A、Darcy PK、Dawson SJ、Voskoboinik I、Trapani JA、Cebon J、Lehner PJ、Dawson MA。 CMTM6 は PD-L1 の発現を維持し、抗腫瘍免疫を調節します。自然。 2017年9月7日;549(7670):101-105. doi: 10.1038/nature23643. Epub 2017年8月16日。PMID: 28813417; PMCID: PMC5706633。

24. Chen JS、Ma E、Harrington LB、Da Costa M、Tian 2018年2月15日。PMID: 29449511; PMCID: PMC6628903。

25. Gootenberg JS、Abudayyeh OO、Lee JW、Essletzbichler P、Dy AJ、Joung J、Verdine V、Donghia N、Daringer NM、Freije CA、Myhrvold C、Bhattacharyya RP、Livny J、Regev A、Koonin EV、Hung DT、Sabeti PC、Collins JJ、Zhang F. による核酸検出CRISPR-Cas13a/C2c2。科学。 2017年4月28日;356(6336):438-442.出典：10.1126/science.aam9321. Epub 2017年4月13日。PMID: 28408723; PMCID: PMC5526198。